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受新冠疫情的影響，病毒樣本保存液的市場需求量突然劇增，市面上也相繼出現了一批批病毒保存液。但是這些保存液良莠不齊，有的不能室溫保存，增加了保存和運輸成本；有的沒有滅活病毒作用，增加了檢測人員的感染風險；有的甚至保存效果不佳，嚴重影響了后續檢測靈敏度。現階段的樣本采集大多還是采用拭子采樣，但是這種侵入性的樣本采集方法頗為“痛苦”，特別不適合兒童或者嬰幼兒的采樣。因此國外最近開始大量使用唾液采樣代替拭子采樣來進行新冠病毒檢測了，并且該方法已被證明與當前的拭子采樣具有同等的敏感性和特異性。
前段時間就有客戶詢問能否用我們的RNA樣本保存液保存唾液中的病毒樣本。但是考慮到RNA樣本保存液通常用于組織樣本，對于唾液樣本的保存可能不太理想，因此我們專門研發了一款適用于液體樣本中病毒RNA保存的新產品——病毒樣本保存液。下面讓我們對比一下新研發的病毒樣本保存液和RNA樣本保存液在唾液樣本中病毒RNA保存方面的效果差異。
一、實驗目的：
對比病毒樣本保存液和RNA樣本保存液對唾液樣本中病毒RNA的保存效果差異。
二、實驗材料：
1. 病毒樣本保存液（Simgen Cat.No.4112100）
2. RNA樣本保存液（Simgen Cat.No.4007020）
3. Carrier RNA（Simgen Cat.No.4003101）
4. 新鮮采集的唾液
5. 電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司，DNP-9082）
6. 旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）
7. 臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）
8. 超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim100）
9. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）
三、實驗方法：
用添加了Carrier RNA的唾液與保存液按比例混合，放入37℃恒溫箱中，每隔一周提取一次RNA，觀察保存液的保存效果。
RNA樣本保存液：唾液=3:1 | 病毒樣本保存液 ：唾液=2：1 |
1. 將混合液上下翻轉混合均勻，吸取100 μl混合液到RNase-free的1.5 ml離心管中，加入300 μl裂解液，旋渦振蕩數秒混合均勻，室溫靜置10分鐘； 2. 加入320 μl無水乙醇，溫和地翻轉離心管3~5次混合均勻； 3. 稍離，吸取液體到核酸純化柱中，13000 rpm離心30秒，棄濾液； 4. 在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WA，離心棄濾液； 5. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，離心棄濾液； 6. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體； 7. 將核酸純化柱置于一個RNase-free的1.5 ml離心管中，加入50 μl RNase Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到RNA。 | 1. 將混合液上下翻轉混合均勻，吸取300 μl混合液到RNase-free的1.5 ml離心管中，13000 rpm離心2 min； 2. 吸取上清到新的1.5 ml離心管中，加入300 μl 70%乙醇，溫和地翻轉離心管3~5次混合均勻； 3. 稍離，吸取液體到核酸純化柱中，13000 rpm離心30秒，棄濾液； 4. 在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WA，離心棄濾液； 5. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，離心棄濾液； 6. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體； 7. 將核酸純化柱置于一個RNase-free的1.5 ml離心管中，加入200 μl RNase Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到RNA。 |
8. 將提取到的RNA在超微量分光光度計上測量濃度，并進行瓊脂糖凝膠RNA電泳檢測。 | |
四、實驗結果：
1. 在超微量分光光度計上用RNase Free Water調零，測量洗脫下來的RNA，結果如下：
37℃保存1周后的結果：
37℃保存2周后的結果：
1、2是RNA樣本保存液保存的唾液樣本提取的RNA；
3、4是病毒樣本保存液保存的唾液樣本提取的RNA。
2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入8 μl提取到的RNA，電泳25分鐘左右，結果如下：
五、討論與分析：
1. 從操作步驟分析，用RNA樣本保存液保存的樣本后續提取操作稍顯復雜，需要用到裂解液，且起始樣本量低，一次提取能夠得到的RNA量較少；而用病毒樣本保存液保存的樣本后續提取更加方便，無需裂解液，且起始樣本量大，一次提取使用的唾液樣本量相當于用RNA樣本保存液保存的唾液樣本的4倍，這對后續檢測來說相當于提高了檢測靈敏度。
2. 因為病毒樣本保存液起始唾液樣本的用量相當于RNA樣本保存液的4倍，因此為了方便比較，將病毒樣本保存液提取的樣本的洗脫體積增加到200 μl。從濃度測量結果顯示，用病毒樣本保存液保存的樣本提取的濃度更高，且隨著37℃放置時間的增加，濃度數值減少的趨勢明顯小于RNA樣本保存液保存的樣本，說明病毒樣本保存液保存唾液中RNA的效果比RNA樣本保存液更穩定。
3. 從電泳圖分析，用病毒樣本保存液保存的樣本提取到的Carrier RNA條帶明顯比RNA樣本保存液保存的樣本提取到的條帶要亮，這與測得的濃度有很好的對應關系。兩種保存液提取的Carrier RNA隨著在37℃放置時間的增加，降解情況變化不大，說明兩種保存液均能在室溫環境（≤37℃）下保護RNA不被水解。
綜上，兩種保存液均能室溫保存唾液樣本中的RNA，且在2周內沒有明顯差異。相比較而言病毒樣本保存液能提取的起始樣本更多，如果用于新冠病毒RNA的核酸檢測靈敏度應該更高。當然這只是用Carrier RNA測試的結果，如果用RNA病毒測試又會有什么樣的結果呢，敬請期待下期實驗結果。